Dipiridamol 42

+

El dipiridamol inhibe reversiblemente la Mengovirus RNA de replicación RESUMEN El dipiridamol es un inhibidor eficaz del crecimiento cardiovirus en cultivo celular. Los efectos de dipiridamol en la replicación Mengovirus in vivo e in vitro se examinaron con la esperanza de que el medicamento podría ser usado como un análogo experimental de la guanidina inhibidor de poliovirus. Guanidina inhibe selectivamente ARN poliovirus traducción síntesis pero no el ARN, y como tal, ha sido una valiosa herramienta de investigación. Aunque guanidina no inhibe la infección cardiovirus, un compuesto con características similares discriminatorias sería experimentalmente útil para trabajo paralelo con estos virus. Hemos encontrado que la formación de placa en Mengovirus HeLa o células L se inhibió casi el 100 por la presencia de 80 M dipiridamol. El efecto inhibidor fue reversible y dirigido un primer paso en el ciclo de replicación. Los estudios con luciferasa que expresan Mengovirus replicones mostraron que la síntesis de proteínas viral no fue afectado por dipiridamol, y en lugar, la síntesis de RNA era el paso dirigido por la droga. Esta evaluación fue confirmada por los análisis directos de traducción viral y actividades de síntesis de ARN en una solución de Krebs-2-deriva sistema in vitro que apoyó la replicación cardiovirus completa, infecciosa. En Krebs extrae, dipiridamol la síntesis de ARN viral inhibe específicamente a más de 95, sin ningún efecto concomitante en la traducción de la proteína viral o procesamiento de la poliproteína. La inhibición observada afectó de forma reversible un primer paso en tanto de cadena negativa y de cadena positiva la síntesis de ARN, aunque la inhibición de la síntesis de cadena positiva fue más profunda que la de la síntesis de cadena negativa. Llegamos a la conclusión de que el dipiridamol es una potente herramienta experimental que distingue fácilmente entre la traducción cardiovirus y funciones de replicación de ARN. Los genomas de ARN de sentido positivo de todos los miembros de la familia Picornaviridae tienen regiones no traducidas 5, seguido de cuadros individuales, siempre abiertos de lectura, 3 regiones no traducidas, y las colas de poli (A). La traducción del marco de lectura está dirigida por un sitio de entrada de ribosoma interno, que se encuentra como parte de la región no traducida 5 (14). Las consiguientes poliproteınas experimentan una progresión de cis y trans escisiones proteolíticas, generando una cascada de productos intermedios y de poliproteína, proteínas maduras individuales. Las proteínas región P1 (1A, 1B, 1C y 1D) se convierten en las unidades estructurales para los nuevos viriones. El P2 (2A, 2B, y 2C) y P3 (3A, 3B VPg. 3C pro. Y pol 3D) proteínas no estructurales son. Durante la infección, P2 y P3 precursores región y proteínas maduras interactúan entre sí, con las proteínas celulares, y con determinados elementos del genoma-actuando en cis para dirigir la síntesis de un nuevo ARN viral. Gran parte de nuestra comprensión actual de los procesos implicados en la replicación del ARN de los picornavirus se basa en estudios con virus de la polio (revisado en la referencia 23). Entre los pasos descritos son una serie discreta de las interacciones proteína-ARN que ayudan a regular la conversión del genoma de la traducción a las plantillas de replicación. Por ejemplo, poli celular (C) - la proteína de unión y viral 3CD precursor de la polimerasa se conocen para unir un motivo de hoja de trébol de ARN cerca del extremo 5 del genoma del virus de la polio (9. 10. 13. 21). En combinación con celulares poli (A) de unión a proteínas PABP1, que enlaza con la región no traducida 3, el complejo intacto supuestamente ayuda a distribuir circulares del genoma y orientar la polimerasa viral (pol 3D) para la iniciación de cadena negativa (13). Entre otras medidas obligados, proteína viral VPg (3B) está uridylylated por pol 3D para formar VPg-PuPu, en las reacciones con plantilla por un cis-actuando internos elemento de replicación (CRE), que, de nuevo, es parte del genoma de ARN (16. 28. 37). Estudios recientes sugieren además que VPg uridylylation puede no ser estrictamente necesario para la iniciación de la síntesis de cadena negativa, sino más bien, sin modificar VPg pueden actuar directamente con la región no traducida 3 (19. 20). En cualquier caso, una vez de longitud completa menos las hebras se han sintetizado, en general se acepta que para poliovirus, nueva iniciación de ARN de cadena positiva requiere la uridylylation de VPg, o VPg que contiene precursores, utilizando el cre interno como molde. ARN alargamiento después de los resultados de la reacción cebados con VPg de nuevo, de larga duración, además de moléculas de cadena. Múltiples o reiterativas iniciaciones de la polimerasa en las mismas plantillas de la hebra minus producen estructuras ramificadas distintivos, replicativa intermedios. Las nuevas hebras más se liberan del complejo y que sirven como mRNAs para la traducción de las proteínas virales más, como plantillas para rondas adicionales de la replicación del genoma, o como los ARN de virión encapsidados en partículas de la progenie maduros. Tan elegante como este modelo es, varias de las características propuestas en el ciclo de replicación del poliovirus (enterovirus), no tienen homólogos o análogos evidentes entre otros géneros de los picornavirus. Aftovirus, cardiovirus, kobuviruses, teschovirus, y hepatoviruses, por ejemplo, carecen 5 motivos de trébol. Ellos tienen diferentes secuencias de la región sin traducir 3, y sus estructuras cre presuntivas se distribuyen en varios lugares en cada genoma diferente. Los patrones de procesamiento de la poliproteína son también único para cada tipo de virus, incluyendo VPg y sus precursores observados. La capacidad de separar las características esenciales de estos esquemas de replicación en paralelo se ha visto obstaculizada en cierta medida por la falta de herramientas moleculares comunes que han demostrado ser esenciales para los sistemas de poliovirus. En particular, el agente antiviral guanidina-HCl es ampliamente reconocido como un potente inhibidor de la replicación del virus de la polio y se emplea de forma creativa en muchos experimentos basados ​​en virus de la polio. Guanidina evita específicamente la iniciación de la síntesis de ARN de cadena negativa (3), lo que permite una separación fácil experimental de las funciones de traducción de ARN de poliovirus de las funciones de la síntesis de ARN. Además, dado que la acción de guanidina es reversible, la abstinencia de drogas pueden iniciar inicio sincronizado de la replicación del ARN para los experimentos in vitro. resistencia guanidina en poliovirus se asocia con mutaciones de nucleótidos en el gen 2C de la región P2, y el fármaco inhibe la actividad ATPasa de 2C poliovirus recombinante (2. 25. 26). Por desgracia, guanidina no tiene actividad similar contra la mayoría de los otros picornavirus, incluyendo cardiovirus (15. 27). Esta especificidad es desconcertante porque el 2C y proteínas en 3D pol comparten similitudes de secuencia definitiva y mecanicistas entre todos los miembros de la familia. Como una sonda inicial en los fundamentos del esquema de replicación-Mengovirus específica, se empleó un sistema de replicación de células libres basado en Krebs-2 extractos de células, similar a la descrita recientemente por Yuri Svitkin (32). Similar a los sistemas basados ​​en células HeLa para de replicación poliovirus novo (17), Krebs-2 extractos admiten todas las funciones necesarias para la síntesis infecciosa cardiovirus, incluyendo la entrada de ribosomas traducción de la proteína dirigida a un sitio interno, poliproteína procesamiento, la replicación del ARN viral, y la formación de virión (32). La naturaleza libre de células de las reacciones permite el acceso experimental directa a cada vía bioquímica. En ausencia de las membranas celulares, las adiciones de drogas o de anticuerpos también son manipulados libremente. Ahora informe uso del sistema de Krebs-2 para caracterizar la actividad antiviral de dipiridamol, uno de los pocos fármacos conocidos por afectar el crecimiento cardiovirus en cultivo de tejidos. El dipiridamol es una purina modificada con aplicaciones terapéuticas comercialmente como un agente antiplaquetario (8). Es también un potente inhibidor de la infectividad Mengovirus a FL y células L (35). Hemos seguido la fuente de esta inhibición a un paso reversible, molecular temprano en la vía de la replicación del ARN Mengovirus. El dipiridamol no afecta al procesamiento de traducción o poliproteína dependiente del sitio de entrada de ribosoma interno in vitro o in vivo, y en este respecto, se comportó como guanidina en sistemas de replicación poliovirus. El dipiridamol es claramente un reactivo nuevo y potente, práctica que debe ser extremadamente útil en experimentos posteriores para comparar y contrastar los eventos específicos en la síntesis de ARN cardiovirus con los de otros picornavirus. Materiales y métodos Virus y células. células H1-HeLa (ATCC CRL1958) se hicieron crecer en cultivos de suspensión con medio de Eagles modificado y 10 de suero de ternera. células de ratón L929 fueron cultivadas en medio RPMI suplementado con suero de ternera fetal 10. Mengovirus recombinante vMwt (6) de propagación en células HeLa y la titulación del virus mediante ensayo en placa eran como se describe (29). En ensayos de inhibición de dipiridamol, las monocapas de células (3 10 6 células) fueron expuestos a virus (200 PFU), durante 30 min a 20 C. Los inóculos se retiró y las células se cubrieron con agar (1), seguido de un medio líquido superposición que contiene dipiridamol (0 a 80 M, Sigma) solubilizado en etanol. Después de 30 h de incubación (37 ° C bajo 5 CO 2) las células se tiñeron con cristal violeta para visualizar las placas. eficiencia de Drogas (porcentaje de inhibición) se define como la relación de las placas formadas en tratados frente a células no tratadas. Los ensayos de reversibilidad de drogas y de tiempo fueron similares, excepto la infección fue con 50 UFP / célula (3 10 6 células). la superposición de medio líquido fue sustituido como se indica con medio fresco (con o sin 80 M dipiridamol), y se recogieron las muestras después de 8 h de incubación (37ºC, bajo 5 CO 2). Las células se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación y los sobrenadantes clarificados se titulan a continuación para la infectividad mediante ensayo en placa. Ribozima ADNc. El replicón Mengovirus pMluz se ha descrito (7). Se codifica un gen de luciferasa de luciérnaga (luc) que sustituye a una porción de la región de la cápside viral de codificación en el contexto de la Mengovirus plásmido PMWT. transcripciones de la polimerasa T7 con plantilla por pMluz comienzan con dos 5 residuos G no virales, antes de que el genoma viral / reportero, y terminan en el lado 3, con un poli (A) 23 - CG secuencia (7). Para crear plásmidos que expresan los transcritos virales sin los exógenos 5 bases, un casete de ribozima auto-escisión (4. 12) se construye a partir de la superposición de cebadores de cDNA y luego ingeniería genética en pMluz. Los cebadores P1 a P8 (Tabla 1) se hicieron reaccionar con polinucleótido quinasa T7 (Promega). Los pares complementarios, P1P2, P3P4 y P7P8, se combinaron, se desnaturalizaron (95ºC), y se dejaron hibridar. Los fragmentos de productos (tres pares) se mezclaron, se trató con ADN ligasa de T4 (Promega), y luego se digirieron con RsrII y NdeI (New England Biolabs), la creación de un fragmento que codifica ribozima que podría ser sustituido por el fragmento análogo en pMluz. Después de la transformación en Escherichia coli MVII90, el plásmido Rz-pMluz se amplificó y luego filtrada por secuenciación de todas las regiones de interés (promotor T7, ribozima, 5 final del genoma Mengovirus). Plásmido Rz-pMluz, con un punto de mutación que inactiva la secuencia de ribozima (resaltado bases en la Tabla 1), era de diseño idéntico, excepto P5P6 P3P4 par de cebadores reemplazado durante la construcción. Los plásmidos Rz-PMWT y Rz-PMWT también fueron similares, excepto que unidas, respectivamente, la de tipo salvaje (Rz) y secuencias (Rz) de ribozima mutante a una secuencia de genoma PMWT intactos, infecciosa. Los ensayos de replicón. Los plásmidos pMluz, Rz-pMluz, y Rz-pMluz fueron digeridos con BamHI antes de las reacciones de transcripción con ARN polimerasa de T7. Los ARN de productos se extrajeron con fenol-cloroformo y luego se precipitaron con etanol. Después de la resuspensión en agua, la concentración de ARN se determinó por absorbancia a 260 nm. monocapas de células confluentes HeLa (1,7 10 6 células por placa de 35 mm) se incubaron (30 min, 20ºC) con el ARN (1 g) y liposomas. Las placas se lavaron y luego se cubrieron con medio de mantenimiento que contiene dipiridamol (0 a 80 M). Después de la incubación (37 ° C bajo 5 CO 2), las placas se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato y se lisaron las células con reactivo de lisis de luciferasa (Promega). Se determinó la actividad de luciferasa en ensayos convencionales (sistema de ensayo de luciferasa, Promega) utilizando un luminómetro Monolight 2010. Aislamiento de Krebs-2 lisados ​​S10. Krebs-2 ascitis propagación de células en ratones y el aislamiento de los lisados ​​S10 fueron como se describe (32). En pocas palabras, los inoculantes de Krebs-2 células (0,4 ml), amablemente proporcionados por Yuri Svitkin de la Universidad McGill, fueron inyectados en las cavidades peritoneales de ratones (6 semanas de edad, hembra, BALB / c). Después de 7 días, los ratones se sacrificaron, se recogieron los fluidos ascíticos y luego se transfirieron a solución salina equilibrada de Earls en hielo. Después de dos lavados con solución salina equilibrada de Earls, las células sedimentadas se suspendieron en Dulbecco modificado medio Eagles sin metionina y se incubaron con agitación suave (2 h, 37ºC). La suspensión se filtró a través de gasa para eliminar las partículas, y luego se recogieron las células por centrifugación y se lavó dos veces con tampón HNG (35 mM HEPES-KOH, pH 7,3, NaCl 146 mM, 11 mM D-glucosa). Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón hipotónico (25 mM HEPES-KOH, pH 7,3, KCl 50 mM, 1,5 mM MgCl 2) y se coloca en hielo (20 min). Las células se rompieron por homogeneización Dounce (15 golpes) y luego complementado con 1/10 de volumen de tampón concentrado (25 mM HEPES-KOH, pH 7,3, 1 M KCH 3 COO, 30 mM de MgCl 2. 30 mM de ditiotreitol). Después de la centrifugación (10.000 g), alícuotas de los sobrenadantes (fracción S10) se congelaron rápidamente en hielo seco antes de su almacenamiento (80C). La síntesis de proteínas, síntesis de ARN, y uridylylation VPg en Krebs-2 lisados ​​S10. El ARN viral (vMwt) fue aislado de viriones sacarosa purificada (29). Las partículas se rompieron con dodecil sulfato de sodio (SDS, 1) y proteinasa K (20 g / ml), seguido de extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. transcripciones virales recombinantes se prepararon como se describe para los ensayos de replicón. traducción y replicación Cardioviral en Krebs-2 lisados ​​programados con estos ARN fueron esencialmente como se describe (32). Los lisados ​​(200 l) se trataron con nucleasa microcócica (150 unidades / ml) en presencia de CaCl 2 (75 mM, 20C, 20 min) antes de EGTA se añadió (a 2 mM), para extinguir la nucleasa. Proteína / reacciones de síntesis de ARN contenían lisado tratado con nucleasa (20 l, o 50 en volumen), nucleótidos (ATP 1 mM, GTP 0,2 mM, CTP 0,2 mM, UTP 0,2 mM), fosfato de creatina (10 mM), la creatina quinasa (0,2 mg / ml), l ácidos (RNA mM de cada uno, sin metionina), tampón de sal (mM KCH 75 3 CO 2. MgCl 1 mM 2. espermidina 0,25 mM), y, o bien ARN del virión (0,5 g) o transcripción amino 0,2 ( 1 g). Cuando se requiere en la etiqueta de proteína, la mezcla se complementó con 35 Smethionine (2 l, 10 Ci / l Amersham), y la incubación fue de 3 h (32C), después de lo cual tampón (8 l, con 1 SDS) Laemmli de carga fue añadido. Las bandas de proteínas se visualizaron después del fraccionamiento PAGE y autorradiografía. Cuando se requiere en la etiqueta de ARN, 32 PCTP (1,5 l, 10 Ci / l, Perkin Elmer) después de 3,5 h de incubación a 32C. Una hora más tarde, los complejos de replicación se recogieron por centrifugación (16.000 g durante 15 min). Los sedimentos se resuspendieron en tampón de muestra 1x Tricina y se analizaron por fraccionamiento en (12) geles de Tris-Tricina-poliacrilamida. Las bandas marcadas se visualizaron por autorradiografía y se cuantificaron por con fósforo. pol 3D recombinante. Mengovirus recombinantes 3D pol se expresó y se aisló usando procedimientos similares a los de los virus de la polio (11). Craig Cameron, Universidad Estatal de Pensilvania, generosamente proporcionado plásmido PM3D que codifica una proteína de fusión 3D pol Mengovirus ubiquitina enlazada. inducción de la proteína después de la transformación de E. coli PM3D BL21 (pCG1) (también proporcionado por Cameron) da como resultado la escisión del resto de ubiquitina y la acumulación de pol 3D. Las células transformadas se cultivaron en 2 caldo YT suplementado con cloranfenicol y kanamicina a 37ºC (A 600 de 0,1). Se añadió isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) (500 M) y se continuó la incubación (3,5 h). Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron dos veces con tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM), antes de la resuspensión (a 4 mg / ml) en tampón de lisis (100 mM KPO 4. 60 M ZnCl 2. 4 g / ml de leupeptina, ditiotreitol 10 mM, y mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2). La lisis se por sonicación (cuatro veces durante 30 segundos cada uno). Se añadió Polyethyleneime (5, 0,0534 l / lisado celular ml) y el residuo celular se separó por centrifugación (100.000 g. 30 min a 4ºC). Se añadió sulfato de amonio (314 g / litro) y la proteína insoluble se recogió por centrifugación (12.000 g. 30 min, 4ºC). El sedimento se volvió a suspender (50 mM Tris-HCl, pH 8,0), se dializó frente a tampón C (12 a 14 h, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 glicerol, 60 M ZnCl 2. 0.1 NP-40, NaCl 50 mM ) y luego se aplica a una columna de Cibacron azul (5 ml, Bio-Rad) que se había equilibrado en tampón C. la elución se realizó con un gradiente de NaCl (50 a 1000 mM). Las fracciones que contenían pol 3D. como se observa mediante electroforesis en gel, se reunieron y se cargó en una columna Q-Sepharose (5 ml, Bio-Rad). Se aplicó un gradiente lineal de NaCl (de 50 a 200 mM). Las fracciones que contenían pol 3D se agruparon, se vuelve a aplicar a una columna fresca Q-Sepharose (0,5 ml, Bio-Rad), y después se eluyó con tampón (50 mM HEPES-KOH, pH 8,0, 20 glicerol, 60 M ZnCl 2 10 mM. - mercaptoetanol, 0,1 NP-40, NaCl 500 mM). La enzima recombinante se ensayó en reacciones (50 l) que contenían proteína pol 3D (1 g), cebador oligo (G) (25 g), poli plantilla (C) (5 g), 32 PGTP (1 l, 10 Ci / l , 3000 Ci / mmol, Amersham), y el tampón (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, mercaptoetanol 10 mM, MnCl 5 mM 2. 60 M ZnCl 2. 0,5 mM GTP). Las muestras se incubaron durante 30 min (30 ° C) antes de la adición de EDTA (a 4 mM). Se determinó la incorporación insoluble en ácido de la etiqueta (duplicar 5-l alícuotas) mediante un ensayo de filtro. RESULTADOS El dipiridamol afecta Mengovirus placas. infección Mengovirus de confluente HeLa o monocapas de células L produce placas de alrededor de 2 mm de diámetro después de 30 h de incubación. Para ambos tipos de células, la presencia de dipiridamol redujo significativamente el número de placas y el tamaño de la placa de una manera dependiente de la dosis (Tabla 2). Aunque la solubilidad del fármaco limita la dosis máxima ensayada a 80 M, a este nivel no hay placas fueron evidentes en las células HeLa, incluso después de 72 h (no se muestran), y los pocos que se formó en las células L fueron minuto en tamaño y difícil de detectar. Las células tratadas con dipiridamol solo eran indistinguibles de las células no tratadas como se determina por microscopía de luz estándar (datos no mostrados). Mengovirus fenotipos de placa en presencia de inhibición dipiridamol placa es reversible. Para determinar si la inhibición dipiridamol fue reversible, el fármaco se eliminó de los cultivos infectados en diversos momentos después de la infección por intercambio con medio libre de fármaco (Fig. 1A). Cuando las células HeLa fueron liberados de fármaco a 1 h después de la infección, el virus se recuperó 7 h más tarde titularon casi tan alta como controles libres de drogas. La exposición a la droga durante tiempos más largos se redujo progresivamente los títulos aparentes en hasta un 10 4 - fold si se analizaron las muestras a 8 h después de la infección. Sin embargo, si el fármaco se ha retirado entre 2 y 6 h después de la infección, y se dejó que las muestras se recuperaran durante un total de 7 a 8 h, la producción de virus normalmente recuperado a niveles casi libres de drogas (no mostrado). Por ejemplo, si el fármaco se eliminó a 2 h después de la infección, el virus se recuperó a 9 h después de la infección se titularon a 9,2 10 8 PFU / ml. Cuando el fármaco se eliminó a 6 h después de la infección, el título alcanzó 5.1 10 8 PFU / ml por 13 h después de la infección. Teniendo en cuenta estos experimentos se iniciaron a 50 PFU por célula, los resultados corroboran fuertemente informes anteriores de que el dipiridamol es un potente inhibidor del crecimiento Mengovirus (35). Además, indican el efecto del fármaco es reversible si se dejó que la infección suficiente tiempo para recuperarse. El dipiridamol y el rendimiento de virus. monocapas de células HeLa se infectaron a una multiplicidad de 50 PFU / célula. muestras de dipiridamol de tratados (DPM) tenían 80 M dipiridamol (en etanol) añadir al medio en el momento de la infección. muestras de dipiridamol de tratar (DPM) se dosificaron con un volumen equivalente de etanol. (A) Medio a partir de cultivos tratados con dipiridamol se intercambió con medio libre de fármaco en los tiempos indicados. Virus se recogió a las 8 h después de la infección y el título se determinó por ensayo de placa. (B) Media a partir de cultivos dipiridamol-sin tratar se intercambió con medio que contiene dipiridamol (80 M) en los tiempos indicados. El virus fue cosechado a las 8 h después de la infección y luego se tituló. El experimento inverso de la adición de la droga en progresivamente más tarde veces después de la infección iniciados reveló que la actividad de fármacos dirigido un primer paso en el ciclo de replicación viral (Fig. 1B). El dipiridamol ya estaba ausente del medio, mayor será el título de virus recuperado. Una vez que la infección se procedió pasado 3-4 h, dipiridamol se hizo menos eficaz en la inhibición de procesos virales. Drogas añadió después de 6 h después de la infección era casi ineficaces en muestras tituladas a las 8 h después de la infección. Se observaron resultados similares para las células infectadas Mengovirus-L (no mostrados). replicones Mengovirus. defectos inducidos por fármacos sobre la traducción del ARN de entrada o en el inicio de la síntesis de ARN se manifestarían de forma equivalente en los ensayos anteriores tan pronto bloqueado pasos en el ciclo de replicación viral. Hemos informado anteriormente de la utilización con éxito de un replicón Mengovirus en el que un gen informador de luciferasa (luc) sustituye parte de la región de la cápside codificante. Este sistema fue utilizado de separar las contribuciones de la traducción del genoma y la síntesis de ARN en el ciclo de crecimiento cardioviral (7). La transfección de pMluz RNA en células HeLa da una respuesta bifásica de luciferasa (por ejemplo, la Fig. 2A) como proteína se traduce primero de los transcritos de entrada (1-3 h), y luego a partir de ARN viral replicado (3-8 h). Un trabajo reciente con replicones similares de poliovirus, sin embargo, ha llamado a esta interpretación en tela de juicio. Para poliovirus, la presencia de dos residuos de guanosina 5 no virales, los artefactos de ingeniería de reacciones de la polimerasa T7, se demostró que influir en la respuesta de luciferasa bifásica de replicones de poliovirus. transcripciones de replicón alternativos adaptados con precisión los extremos 5 virales, mediante el uso de ribozimas secuencias codificadas por plásmidos, se encontraron para iniciar la replicación en ocasiones anteriores, y el desfase entre la traducción del ARN de entrada y la traducción del ARN nueva era relativamente disminuidas (12). Antes de probar con dipiridamol Mengovirus replicones, parecía prudente investigar en primer lugar si los extremos 5 de transcripción del mismo modo influirían en ensayos análogos con secuencias Cardiovirus. Los ensayos de replicón. (A) monocapas de células HeLa fueron transfectadas con ARN transcrito a partir de plásmidos replicón Mengovirus o falsamente transfectadas (simulacro). En los momentos después de la transfección se ha indicado, se cosecharon y se lisaron las células y se determinó la actividad de luciferasa en el citoplasma. unidades relativas de luz (RLU) son valores para duplicado (20 l) muestras promediadas. (B) Las muestras se trataron como en A, excepto que el dipiridamol (80 M en etanol) se añadió al medio de una serie de muestras Rz-pMluz en el momento de la transfección. Las muestras de control tenían volúmenes equivalentes de etanol añadido al medio. En consecuencia, activos casetes de ribozima (Rz-pMluz) e inactivo (Rz-pMluz) se incorporaron en plásmidos pMluz. Los ARN resultantes tenían 0 o 50 no virales 5 bases, en comparación con las dos bases no virales (GG) en el extremo 5 de pMluz. Cuando se ensayó en las células, y en contraste con los informes de poliovirus (12), todas las transcripciones Mengovirus competentes para la replicación todavía mostraron la producción de luciferasa bifásica (Fig. 2A) que discriminaba de entrada de la traducción del ARN replicado. La fase de retardo inicial para Rz-pMluz terminó en aproximadamente 3 h después de la infección, más o menos al mismo tiempo que el retraso que se muestra por las otras transcripciones replicantes que contienen nucleótidos no virales. Por lo tanto, la presencia de un auténtico viral 5 final no alteró la fase de retardo, como se ha informado para poliovirus (12). Como poliovirus, sin embargo, Mengovirus ARN con extremos virales precisas (Rz-pMluz) luego se convirtió en 5 a 10 veces más eficaz plantillas de replicación con respecto a los que tienen dos (pMluz) o 50 (Rz-pMluz) bases heterólogos. Las muestras de control con polimerasas defectuosos (pMluz la edad) no pudo convertir ARN se traduce en plantillas de replicación, independientemente del tiempo de incubación. Como era de esperar, los niveles bajos de luciferasa continuaron siendo sintetizado a partir de dichos transcritos, hasta que, presumiblemente, se degradan (6 h). El replicón Mengovirus ribozima de gran actividad se ensayó posteriormente para la sensibilidad dipiridamol (Fig. 2B). Inicialmente, la luciferasa se produce a partir del ARN de entrada en niveles similares a las muestras tratadas no farmacológicos, lo que sugiere que la traducción inicial genoma no fue el paso afectados por el fármaco. Claramente, sin embargo, dipiridamol impidió la siguiente fase, dependiente de la replicación de la síntesis de proteínas, y la curva de drogas paralelo esencialmente la de las muestras de control programados con polimerasa inactiva (PMWT-edad). Krebs-2 ensayos con RNA del virión. En 2003, Svitkin y Sonnenberg (32) describen un sistema de lisado de Krebs-2 altamente eficaz que permitió el examen in vitro de todos los pasos en el ciclo de replicación del virus de la encefalomiocarditis. Con el asesoramiento y los reactivos proporcionados generosamente por Y. Svitkin, reproducimos este sistema, y ​​estableció que cuando se programa con ARN mengovirion o con transcripciones Rz-PMWT, Krebs-2 lisados ​​sintetizados por lo menos 10 8 PFU / ml de progenie infecciosa Mengovirus dentro de 20 h (no mostrada). Una característica clave de cualquier ensayo libre de células es que los productos de traducción y replicación virales pueden ser fácilmente etiquetados y controlados. La adición de 35 Smethionine a los extractos programado con RNA Mengovirus virión dio el panel completo de precursores virales esperados y los productos de escisión (Fig. 3. carril 2). La adición de dipiridamol 80 M o su disolvente, etanol, no alteró significativamente este patrón (Fig. 3. Los carriles 3 y 4). Pero, cuando la síntesis de RNA se controló por la adición de 32 PCTP, el fármaco era claramente inhibidora (Fig. 4). reacciones estándar (Fig. 4. carril 1), o reacciones estándar complementada con etanol (Fig. 4. carril 2), dieron fuertes bandas de ARN del genoma, así como forman complejos intermedios replicativos y replicativas. Las muestras a las que se habían añadido 20, 40, o 80 M dipiridamol (Fig. 4. carriles 4, 5 y 6, respectivamente), dio bandas secuencialmente más débiles, lo que indica una inhibición dependiente de la droga de la síntesis de RNA viral. A 80 M dipiridamol, la síntesis de ARN de cadena simple Mengovirus se inhibió 96. La síntesis de proteínas en los ensayos libres de células. Krebs-2 lisados ​​programados con Mengovirus RNA se marcaron con 35 Smethionine como se describe en Materiales y Métodos. Las proteínas se fraccionaron por electroforesis en gel de poliacrilamida y se detectan por autorradiografía. Las reacciones contenían no RNA (carril 1) sin adiciones (carril 2) 80 M dipiridamol (DPM, carril 3) o 1,25 etanol (EtOH, carriles 3 y 4). Las posiciones de migración de las proteínas Mengovirus conocidos se indican. la síntesis de ARN en ensayos libres de células. Krebs-2 lisados ​​programados con Mengovirus RNA fueron pulso marcado con 32 PCTP como se describe en Materiales y Métodos. Las reacciones contenían no RNA (carril 6) sin adiciones (STD, carril 1) 1,25 etanol (carriles 2 a 5) o 20, 40, o 80 M dipiridamol (DPM) (carriles 3 a 5). Las muestras se fraccionaron en geles de agarosa al 1 nativas, y las bandas marcadas se visualizaron por autorradiografía. de STD es la intensidad relativa de las bandas de cadena sencilla del genoma, como se determina por phosphorimaging y software ImageQuant. RI / RF, forma intermedia / replicativa replicativa. El hecho de que la replicación del ARN, pero no se vio afectada por traducción in vitro dipiridamol fue consistente con los resultados de replicón y ensayos de reducción de placa. Pero, si dipiridamol afectada específicamente la síntesis de ARN, el paso orientadas deben también tener en cuenta la reversibilidad de drogas. En consecuencia, Krebs-2 lisados ​​programados con ARN de virión se incubaron en presencia o ausencia de dipiridamol. Después de 4 h, los complejos de replicación se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en lisados ​​frescos (con o sin fármaco), y después se dejó sintetizar ARN marcado durante una hora adicional (Fig. 5). A menos que el dipiridamol estuvo presente durante los dos períodos de incubación (Fig. 5. carril 2), las muestras acumuladas nuevo ARN viral a (aproximadamente) cantidades equivalentes. Cuando dipiridamol se retiró después de la primera incubación, la síntesis de ARN se recuperó a niveles normales (Fig. 5. comparar los carriles 1 y 3), lo que confirma el efecto in vitro sobre la síntesis de ARN viral era de hecho reversible. Por otra parte, incluso cuando dipiridamol estuvo presente durante el segundo período de incubación, si la incubación anterior había estado libre de drogas (Fig. 5. carril 4) la síntesis de ARN pudo continuar. Este patrón sugiere fuertemente dipiridamol dirigido la formación o activación de los complejos de replicación recién reunidos, pero no la progresión de los complejos preformados. reversibilidad dipiridamol en Krebs-2 ensayos. Krebs-2 lisados ​​programados con ARN de virión Mengovirus se incubaron durante 4 h a 32ºC en presencia (carriles 2 y 3) o ausencia (carriles 1 y 4) de 80 M dipiridamol (DPM). Los complejos de replicación se recogieron por centrifugación a 16.000 g y después se resuspendieron en lisados ​​frescas en la presencia (carriles 2 y 4) o ausencia (carriles 1 y 3) de 80 M dipiridamol. Se añadió 32 PCTP y la incubación se continuó durante 1 h. Las muestras se fraccionaron en geles de agarosa al 1 nativas, y las bandas marcadas se visualizaron por autorradiografía. Uridylylation de VPg y / o sus precursores es uno de los eventos clave requeridos temprano en la replicación del ARN picornaviral (19. 20). Para determinar si el dipiridamol interfirió con este paso, se analizó la síntesis de VPg-Pupu en Krebs-2 lisados ​​programados con ARN de viriones en presencia y ausencia del fármaco (Fig. 6). Después de 3,5 h de incubación, las reacciones estándar se pulse-etiquetados con 32 PUTP durante una hora adicional. complejos de replicación, incluyendo VPg-Pupu, se recogieron por centrifugación, se fraccionaron en geles, y se analizó la etiqueta. Mientras uridylylated (etiquetado) VPg se detectó en la reacción estándar (Fig. 6. carril 2), poca o ninguna etiqueta VPg fue evidente en presencia de dipiridamol (Fig. 6. carril 3), o la muestra modelo de infectados (Fig . 6. carril 1). Este experimento es consistente con la idea de que el dipiridamol dirigido un primer paso en el ciclo de replicación, pero no aclara si la inhibición de la uridylylation es la causa o la consecuencia de defectos drogodependientes globales más, como por ejemplo un montaje incorrecto o la transformación de los complejos de replicación. Dipiridamol y uridylylation VPg. Krebs-2 lisados ​​programados con: no RNA (carril 1), vMwt RNA (carril 2), o vMwt ARN más dipiridamol (DPM) (80 M, carril 3) se pulse-etiquetado con - 32 PUTP de 1 h como se describe en Materiales y métodos. complejos de replicación se recogieron por centrifugación, se fraccionaron en geles de Tris-Tricina, y se visualizaron por autorradiografía. La flecha indica la migración conocida de VPg-Pupu. Krebs-2 ensayos con transcrito de ARN. Como se discutió anteriormente, se sabe que los 5 extremos de las transcripciones poliovirus replicón para afectar a la eficiencia global y el momento de la síntesis de ARN, después de la transfección en las células. Los extras no virales 5 bases tienen efectos más fuertes sobre el poliovirus, más o selección de la plantilla de cadena negativa en reacciones libres de células, donde es menos probable (12) de reparación fortuita de extremos defectuosos. Chem. Antimicrob. Mol. Antimicrob. Chem. Chem. IV. Antimicrob.